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血清总补体溶血活性(CH50)测定操作说明书

发布时间:2016-03-03 10:34 |  点击次数:

                                       血清总补体溶血活性(CH50)测定操作说明书

利用绵羊细胞与相应抗体(溶血素)结合成的复合物,可激活血清中的补体,导致红细胞溶解,当红细胞和溶血素量一定时,在规定反应的时间内,溶血程度与补体量及活性呈正相关。在接近50%溶血(CH50)时,二者之间近似直线关系,故以50%溶血作为最敏感的判断终点。以引起50%溶血所需的最小补体量为一个CH50U,可计算出待测血清中总的补体溶血活性,以CH50U/ml表示。
  本试验主要反映补体经典活化途径的溶血功能,其结果与补体C1~C9各组成分的量及活性均有关。

1. 试剂及配制
(1)缓冲生理盐水:
① 贮存液:
Na2HPO4·12H2O     2.85g
KH2PO4            0.27g(加蒸馏水至100毫升,4℃保存)
NaCl             17.00g
② 应用液(缓冲液):5毫升贮存液加95毫升蒸馏水,再加10%硫酸镁0.1毫升。当日配制。12小时内使用。

(2)2%绵羊红细胞:无菌采取绵羊血液,于等量Alsever液中可保存3周。用前以缓冲液洗3次,并配成2%细胞悬液。必要时可用吸光光度法或细胞计数法使悬液细胞浓度标准化。
(3)溶血素:将本品(效价1:4000),用缓冲液做1:2000倍稀释。
(4)待测血清:新鲜血液室温放置30分钟,再4℃放置60分钟,使血块收缩。4℃离心(3000r/min)10分钟,取上清,-20℃保存。
2.试管法操作步骤(改良Mayer法)
(1)致绵羊红细胞:2%绵羊红细胞加等量溶血素(1:2000),混匀,置37℃水浴30分钟。
(2)稀释血清:待测血清0.2ml,加缓冲液3.8ml,稀释度为1:20。
(3)配制溶血标准管:2%绵羊红细胞2ml加8ml蒸馏水,混匀,即为全溶血管。取全溶血管液2ml加缓冲液2ml,即为50%溶血管。
(4)按表所示,依次加各成分于试管中,混匀,置37℃水浴30分钟。第10管为非溶血对照。
补体CH50测定试管法
成     分 试     管      号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1:20待测血清 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 -
缓冲液(ml) 1.40 1.35 1.30 1.25 1.20 1.15 1.10 1.05 1.00 1.50
致敏红细胞(ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
(5)结果测定:取出试管,2000r/min离心10分钟,对照管应不溶血。肉眼比色,选与50%溶血标准管相近二管,再用分光光度计测(波长542nm、0.5cm比色杯)OD值,确定与标准管最接近者为终点管,然后按下公式计算CH50值:血清补体CH50(U/ml)=(1/血清用量)×稀释度。
如第5管为终点管,测待测血清中CH50为66.7U/ml。血清补体CH50正常值为50-100U/ml。
我公司可提供配套实验用4%绵羊红细胞  溶血素(兔抗绵羊红细胞)巴-比-妥缓冲液  
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